La Reacción en cadena de la polimerasa

 Apareció en los años 80 otra técnica revolucionaria que permite tener mucha cantidad de un fragmento de ADN de interés: es la técnica de PCR, o “reacción en cadena de la polimerasa”.

Es una técnica muy rápida, que por otra parte puede funcionar partiendo de trazas de ADN. Por ello se utiliza mucho en el área forense y de identificación humana, así como en genética de poblaciones, en casos en los que se tiene muy poquito ADN.

Permite amplificar fragmentos de DNA mil millones de veces en unas pocas horas. Puede utilizarse con cantidades extremadamente pequeñas de DNA original. Incluso con una sola molécula. La reacción en cadena de la polimerasa ha revolucionado la biología molecular y es en la actualidad una de las técnicas moleculares más utilizadas. La base de la PCR es la replicación catalizada por una DNA polimerasa. La replicación en este caso tiene dos requisitos fundamentales:

1     1)   Un molde de DNA monocatenario a partir del cual puede copiarse una nueva cadena de            DNA.

      2)   Un cebador con un grupo 3’-OH al que pueden agregarse los nuevos  nucleótidos.

Debido a que una molécula de DNA consta de dos cadenas de nucleótidos, cada una de ellas puede servir como molde para producir una nueva molécula y la cantidad de DNA se duplica en cada replicación. Los cebadores utilizados  en la PCR son fragmentos cortos de DNA, generalmente de 17 a 25 nucleótidos de longitud, que son complementarios a secuencias conocidas en el molde.

Para llevar a cabo la PCR se comienza con una solución que incluye el DNA diana (DNA por ser amplificado). La DNA polimerasa, los cuatro desoxirribonucleosidos trifosfatos (dNTP: los sustratos para la DNA polimerasa), los cebadores, iones magnesio y otras sales necesarias para que se produzca la reacción. Una reacción en cadena de la polimerasa típica incluye tres pasos.

En el paso 1. La solución de comienzo de DNA se calienta entre 90 y 100ºC para romper los puentes de hidrogeno entre las dos cadenas de nucleótidos y producir así los moldes monocaterianos necesarios. La mescla de reacción se mantiene a esta temperatura durante solo 1 o 2 minutos. En el paso 2, la solución de DNA se enfría con rapidez a una temperatura de entre 30 y 65ºC. y se mantiene así durante 1minuto o menos.

Esta técnica aprovecha las características de la replicación del ADN, es decir que a partir de un pequeño cebador la polimerasa puede proseguir una cadena. El requisito es poder diseñar dos cebadores adecuados. Por la posición de estos cebadores, al cabo de una serie de rondas de replicación, (hablamos de una reacción en cadena), tenemos grandes cantidades de un solo trozo, el tramo que va desde uno de los cebadores al otro. Esta técnica, en la que el ADN tiene que ser desnaturalizado por calor para iniciar cada nuevo ciclo se tornó muy fácil cuando hizo uso de una polimerasa que resiste el calor (aislada de una bacteria de aguas termales). Esta técnica se utiliza ya rutinariamente para muchos diagnósticos.

PCR como herramienta de diagnostico como los cebadores utilizados en la PCR son específicos para secuencias de DNA conocidas la PCR puede utilizarse para detectar la presencia de una secuencia en especial en una muestra. Por ejemplo, a menudo se utiliza la PCR para detectar la presencia de virus en muestras de sangre al desarrollar la reacción con cebadores complementarios para secuencias de DNA viral conocidas. Si el  DNA viral está presente los cebadores se unirán a él y la PCR amplificara un fragmento de longitud conocida. La presencia de un fragmento de DNA de la longitud buscada en el gel indica la presencia del DNA viral en la muestra de sangre. Las pruebas de diagnostico modernas para la infección por HIV, el agente causal del sida, utilizan este tipo de amplificación por PCR de las secuencias del virus. 

 PCR en el tiempo real: puede utilizarse para determinar cuantitativamente la cantidad inicial de ácidos nucleicos. En este procedimiento, la reacción de PCR habitual se utiliza para amplificar un fragmento de DNA determinado, y un instrumento sensible determina exactamente la cantidad de DNA presente en la solución después de cada ciclo. Con frecuencia se utiliza en la reacción una sonda que posee fluorescencia y que es específica para la secuencia de DNA de interés y, por lo tanto, se mide solamente el DNA de interés.

A menudo la PCR en tiempo real se combina con la PCR de transcripción inversa para medir la cantidad de mRNA en una muestra, lo que permite a los biólogos determinar el nivel de Expresión de un gen en diferentes células y bajo diferentes condiciones. Por ejemplo: los investigadores interesados en ver cómo cambia la expresión de un gen en respuesta a la administración de un medicamento, a menudo utilizan PCR en tiempo real para medir cuantitativamente la cantidad de mRNA producido por genes específicos en las células expuestas al fármaco y para comparla con la cantidad de mRNA producida por los genes de células control sin exposición a esa sustancia.

La Reacción en cadena de la polimerasa PCR  Es un método que no utiliza células, rápido y sensible, aplicado para multiplicar fragmentos de DNA, que puede llevarse a cabo utilizando una maquina automatizada (denominada termocicladora).

A) LA PCR estándar.- es un procedimiento invitro que permite amplificar secuencias de DNA definidas a partir de pequeñas cantidades de DNA de diferentes orígenes.

Esta ampliación requiere alguna información previa acerca de las secuencias que flanquean el DNA blanco. Sobre la base de esta información se diseñan 2 oligonucleotidos cebadores de alrededor de 15 a 25 pares de bases de longitud. Los cebadores son complementarios de las secuencias por fuera de los extremos 3` del sito blanco y se unen a ellas en forma específica.

Durante la PCR las moléculas de DNA de cadena doble se desnaturalizan, cada cadena simple sirve como molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria en condiciones controladas. La PCR es una reacción en cadena de 25 a 30 ciclos.

Cada ciclo, que involucra 3 reacciones rigurosamente controladas en tiempo y temperatura en los termocicladores automáticos, lleva alrededor de 1-5 minutos. Los tres pasos en cada ciclo son:

1) Desnaturalización del DNA de cadena doble, a alrededor de 93-95ºC para el DNA humano.

2) Hibridación del cebador a unos 50-70ºC que depende de la temperatura de fusión esperada del dúplex de DNA.

3)  Síntesis del DNA, que utiliza una DNA polimerasa termo resistente típicamente a unos 70-75ºC.

 En cada ciclo subsiguiente, el molde original (ilustrado en azul) y el DNA nuevo sintetizado durante el ciclo anterior (ilustrado en rojo), actúan como molde para otra vuelta de síntesis. El primer ciclo de longitudes variables (que se muestran con la flecha) en el extremo 3’ porque la síntesis continua mas allá de la secuencia blanco. Sin embargo en los ciclos subsiguientes las cadenas variables son rápidamente superadas en número por nuevo DNA de longitud fija en ambos extremos por que ls síntesis no puede sobrepasar el final, hay al menos 10elevado a la 5, copias de la secuencia blanco especifica.

Esta se puede visualizar como una blanda distintiva de un tamaño especifico luego de una electroforesis en gel. Además del método estándar, se ha desarrollado una amplia variedad de métodos basados en la PCR para cumplir con diferentes propósitos.

B) PCR inversa.- Este enfoque utiliza mRNA como material de partida. Después de la unión del primer cebador se sintetiza DNA nuevo complementario mediante transcripción inversa. Este es utilizado como molde para una nueva cadena de DNA. Luego se producen múltiples copias de cDNA por PCR.

C) PCR específica de alelo.- esta se diseña para amplificar a una secuencia de DNA de un solo alelo únicamente y para excluir al otro alelo. Por ejemplo, si el alelo 1 contiene un par de bases AT en un sitio particular (1) y el alelo 2 un par CG (2), ambos alelos pueden distinguirse con una  PCR específica de alelo (3 y 5). Si una mutación cambio la T por una C en el alelo 1, el oligonucleótido del cebador específico no se une perfectamente, y la amplificación se vuelve imposible (4). De modo similar, si una C fue reemplazada por una A en el alelo 2, no es posible la amplificación específica del alelo (6). Puede utilizarse una transcripción inversa PCR cuando las secuencias  conocidas de los exones están muy separadas dentro de un gen. Con la amplificación rápida de los exones de cDNA, se puede aislar las secuencias de los extremos 5’ y 3’ a partir del cDNA. Otras variaciones de PCR SON LA Alu-PCR, la PCR anclada, la PCR en tiempo real, y otras.

  

Jazmín Espinoza
Grupo: 8